隨著常規(guī)PCR技術(shù)在分子生物學(xué)各個領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，非特異性擴(kuò)增等現(xiàn)象也經(jīng)常出現(xiàn)，造成實驗結(jié)果的不準(zhǔn)確性。

非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生和影響

普通的Taq DNA 聚合酶的最適溫度是72℃，此時酶的活性最佳，低于此溫度，酶有較弱活性。在PCR擴(kuò)增的升溫過程中，酶發(fā)揮較弱的活性，體系極易錯配或形成引物二聚體，尤其是當(dāng)設(shè)計的引物3’端是G 或C，錯配的鏈很難重新解開。非特異性擴(kuò)增正是由于DNA聚合酶低溫下具有活性而引起的錯誤引導(dǎo)靶標(biāo)延伸和引物二聚體形成的。

非特異性擴(kuò)增的具體影響包括：

• 目標(biāo)擴(kuò)增子產(chǎn)量低；

• 目標(biāo)擴(kuò)增子的靈敏度下降；

• 下游應(yīng)用效果不佳。

因此，要提高PCR 擴(kuò)增的特異性和降低反應(yīng)錯配率，可以人為的控制酶的活性，在72℃之前讓酶不發(fā)揮活性，這樣就避免了在升溫（或配置反應(yīng)體系）過程中發(fā)生鏈的錯配，從而保證擴(kuò)增的特異性。

而目前最常用的提高PCR特異性的方法是使用熱啟動型Taq DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，即熱啟動PCR。

熱啟動PCR  

熱啟動PCR，主要利用酶的修飾物在常溫下抑制DNA聚合酶的活性，加熱到變性溫度時修飾物失活，酶活得以釋放，從而使PCR反應(yīng)正常進(jìn)行。

熱啟動PCR的優(yōu)勢：

• 阻止引物與低同源性的模板序列結(jié)合；

• 在PCR反應(yīng)開始之前，防止引物與引物之間形成引物二聚體；

• 提高目的片段的擴(kuò)增靈敏度和產(chǎn)量；

• 可在室溫下配制反應(yīng)體系和設(shè)置反應(yīng)程序，使操作更為便利，且不會影響擴(kuò)增性能和特異性。

熱啟動 Taq DNA聚合酶的修飾方法

熱啟動Taq DNA 聚合酶常用的修飾方法有化學(xué)修飾法、抗體法和配體修飾法等。其中化學(xué)修飾法和抗體法最為常用。雖然它們都能抑制室溫下的聚合酶活性，但兩者之間存在一些差異。

化學(xué)修飾法

化學(xué)修飾法熱啟動Taq DNA聚合酶：一般采用化學(xué)小分子，如酸酐，與聚合酶上的氨基酸基團(tuán)（賴氨酸）結(jié)合，使酶低溫時失去酶活。加熱至特定溫度和時間后，化學(xué)小分子與氨基酸之間的化學(xué)鍵斷裂，酶活釋放，從而達(dá)到熱啟動效果。化學(xué)修飾可有效封閉酶的活性，操作簡單，酶活性釋放速度較慢，酶活性維持更加穩(wěn)定且無任何外源DNA污染，性價比更高。

但是，酶激活時間較長可能會影響酶的活性，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量降低。

檸康酸酐與酶結(jié)合的原理

一般認(rèn)為Taq DNA聚合酶上賴氨酸基團(tuán)有42個左右，但是由于空間結(jié)構(gòu)限制，其中一部分賴氨酸基團(tuán)在基團(tuán)內(nèi)部，無法與化學(xué)修飾基團(tuán)相結(jié)合。

抗體法

抗體法熱啟動Taq DNA聚合酶：一般使用Taq DNA聚合酶抗體，在PCR反應(yīng)高溫加熱前，抗體與DNA聚合酶結(jié)合，封閉酶活性。在加熱至變性溫度時抗體變性，解除封閉從而釋放酶活性。此外，抗體型熱啟動酶由于酶活釋放速度快，可大大降低PCR反應(yīng)時間，且具有更高的靈敏度和擴(kuò)增效率。

但其缺點是抗原抗體結(jié)合是一種動態(tài)平衡，試劑配比優(yōu)化時間長。

抗體與DNA聚合酶特異性結(jié)合封閉原理示意圖

兩種熱啟動修飾方法的比較

優(yōu)質(zhì)的熱啟動 Taq DNA聚合酶

熱啟動PCR目前的應(yīng)用已是非常廣泛，在較難擴(kuò)增的PCR反應(yīng)如基因組DNA、單拷貝序列的擴(kuò)增、多重PCR和超長片段的擴(kuò)增中的應(yīng)用尤為突出。

優(yōu)質(zhì)的熱啟動Taq DNA聚合酶，能有效降低或消除非特異性產(chǎn)物以及引物二聚體的形成，提高引物與模板結(jié)合的效率。進(jìn)一步提高目的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物量，使PCR反應(yīng)更趨于完美。

GenStar相關(guān)產(chǎn)品：

HotStart Taq DNA Polymerase（Cat#A131）

• 靈敏快速：抗體修飾熱啟動酶，擴(kuò)增靈敏度更高，反應(yīng)速度快；

• 性能優(yōu)異：擴(kuò)增效率高，重復(fù)性好，跨度均一；

• 兼容性強(qiáng)：適用于各種PCR或qPCR反應(yīng)體系。

HotStart Power Taq DNA Polymerase（Cat#A135）

• 特異性強(qiáng)：化學(xué)修飾熱啟動酶，酶活封閉更完全，有效抑制非特異性擴(kuò)增；

• 性能穩(wěn)定：95℃加熱10 min，徹底釋放酶活性；

• 適合復(fù)雜模板：適用于從復(fù)雜模板中擴(kuò)增低拷貝基因。

產(chǎn)品列表

主要參考資料:

Saiki RK，Scbarf S，F(xiàn)aloona F，el a1．Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site anaylisis for diagnosis of sickle cell anemia[J]．Science，1985，230(4732)：1350-1354.

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Hiroshi M, et al. Characterization and Application to Hot Start PCR of Neutralizing Monoclonal Antibodies against KOD DNA Polymerase. [J].Synthetic Chemistry and Biological Chemistry.1999, 126(4):762.

周曉薇，朱雪蛟，田玲，等．耐熱Taq DNA聚合酶的酸酐修飾及其在降低PCR非特異性擴(kuò)增中的應(yīng)用評價[J]．浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，23(3)：500—505．